Naissance gemellaire après diagnostic pré-implantatoire de mucoviscidose et de sexe
P.F. RAY*, N. FRYDMAN**, T. ATTIE*, V. KERBRAT**, S. ROMANA*, M. VEKEMANS*, A. MUNNICH*,R. FRYDMAN**
* Département de génétique, U393, IRNEM, Hôpital Necker Enfants Malades - PARIS.
** Service de gynécologie-obstétrique, Hôpital Antoine Béclère - CLAMART.
 

Pour les couples à risque de transmettre une maladie génétique díune particulière gravité, le diagnostic pré-implantatoire permet, après fécondation in vitro, de sélectionner et de transférer uniquement les embryons ne présentant pas de risque de développer la maladie génétique recherchée. Le couple évite ainsi líattente associée au diagnostic prénatal pratiqué entre la 10e et la 16e semaine de grossesse, et líinterruption médicale des fútus atteints (Handyside et coll., 1997 ; Ray, 2001).

Le contexte
 
 

Fig. 1 : Arbre généalogique. La couleur rose indique le statut pour le retard mental. X indique les porteuses saines probables car présentant un fort biais díinactivation du chromosome X. Les individus atteints de mucoviscidose sont représentés en mauve et les hétérozygotes sont indiqués par un petit point mauve.

Deux súurs ont été reçues en consultation pluridisciplinaire de diagnostic pré-implantatoire pour un risque de retard mental lié au chromosome X. Líorigine génétique du retard mental affectant les deux frères de nos patientes nía pas pu être caractérisée, cependant, un biais díinactivation du chromosome X était retrouvé chez la mère (I:1) et une des súurs (II:1), renforçant líhypothèse díune ségrégation liée à líX (fig. 1). Un test génétique à la recherche des mutations responsables de mucoviscidose fut initié car une des nièces par alliance de la patiente II:1 était atteinte. Líanalyse génétique des deux couples montra que II:1 et son conjoint étaient tous les deux porteurs de la mutation DF508, prédominante dans la population caucasienne. En plus du diagnostic de sexe nécessaire pour éviter le transfert díembryons XY potentiellement atteints, ce couple présentait donc un risque (25 %) díengendrer des enfants atteints de mucoviscidose.
 

Commentaire

Suite à la demande de ce couple, nous avons développé un double test génétique par PCR multiplex permettant de déterminer à la fois le sexe et le statut génétique au locus  DF508. Ce test fut validé sur 98 lymphocytes uniques isolés manuellement sous contrôle visuel à líaide díun microscope inversé. Quatre-vingt-seize des cellules analysées donnèrent un résultat positif (98 % díamplification). Sur ces 96 cellules, 2 donnèrent un diagnostic de sexe, donnant un risque díerreur de 2 % pour le diagnostic de sexe.

Deux erreurs furent aussi observées pour le diagnostic de mucoviscidose. Dans ces deux cas, des cellules hétérozygotes étaient diagnostiquées comme homozygotes saines. Dans la mesure où la mucoviscidose est une maladie récessive et que les hétérozygotes sont porteurs sains, ce type díerreur níaurait pas díincidence sur la santé de líenfant.

Pour limiter les risques díerreurs diagnostiques, et en particulier le risque díerreur sur le sexe des embryons, il a été décidé de prélever, lors de la biopsie embryonnaire pratiquée au troisième jour de développement après fécondation in vitro, deux cellules pour chaque embryon. Il a été démontré précédemment quíune réduction díun quart de la masse cellulaire au 2^e ou 3^e jour après fécondation níavait pas díincidence significative sur le développement embryonnaire ultérieur (Hardy et coll., 1990).

Dans ces conditions, un test effectué sur deux cellules différentes provenant díun même embryon et donnant des résultats concordants abaisserait notre risque díerreur diagnostique à 0,04 %.
 

La réponse

Un premier DPI a été réalisé, 15 complexes ovocytaires ont été aspirés, 10 ont été fécondés par injection cytoplasmique díun spermatozoïde (ICSI) et tous les embryons furent biopsiés et analysés (tableau I). Un résultat a été obtenu pour 9 embryons, 4 étaient du phénotype requis, i.e. féminin homozygote sain ou hétérozygote. Parmi ces embryons, les trois présentant les meilleurs critères morphologiques furent transférés. Cette procédure se solda par un échec de grossesse.

Cinq mois après, une deuxième tentative a été réalisée. Cette fois-ci, 20 complexes ovocytaires ont été aspirés et 15 ovocytes ont été fécondés et biopsiés (tableau I). Un diagnostic nía pas pu être posé avec un seul embryon. Les 14 autres embryons se répartissaient de la manière suivante : 6 embryons masculins (3 hétérozygotes et 3 homozygotes non délétés), 8 embryons féminins (3 hétérozygotes et 3 homozygotes non délétés et 2 homozygotes délétés).
 

La figure 2 montre les résultats de líanalyse génétique par PCR pour les quatre premiers embryons analysés. Líembryon 1 est de sexe féminin et homozygote délété, líembryon 2 est féminin, homozygote non délété, líembryon 3 est féminin hétérozygote et líembryon 4 est masculin hétérozygote. On voit que pour líembryon 4 ont été analysées 3 cellules. Dans la 2^e cellule, on remarque une discordance : líallèle sain au locus DF508 níest pas amplifié, illustrant un phénomène díallèle ìdropoutî (absence díamplification díune des deux allèles (Ray et al., 1996)).
 

Fig. 2 : Amplification multiplexe du locus DF508 et du gène de líamélogénine et de son pseudogène sur le Y. Les numéros correspondent aux numéros des embryons. M correspond au marqueur de taille (marqueur VIII, Roche Diagnostics), les deux bandes font 124 et 110 bp ; Y indique le fragment díADN amplifié du pseudogène de líamélogénine, X le produit de líamélogénine, CF líallèle sauvage au locus CFTR et DF le fragment délété DF508.

Du fait de la bonne qualité des embryons, seulement deux embryons féminins (un homozygote et un hétérozygote au locus DF508) furent choisis pour le transfert. Des dosages élevés díhCG indiquèrent líimplantation, puis une grossesse gémellaire fut détectée par contrôle échographique. Le sexe des fútus fut confirmé par contrôle échographique. La patiente ne désira pas prendre le risque díun prélèvement invasif tel quíune biopsie de trophoblaste ou une amniocentèse pour confirmer le diagnostic de mucoviscidose.

Les jumelles sont nées par césarienne après un terme de 37 semaines. Elles pesaient respectivement 2,880 kg, 2,990 kg. Le génotype de porteuse saine et non porteuse de la mutation DF508 fut confirmé.

La súur de cette patiente (II:4) donna naissance à une petite fille en bonne santé après un deuxième DPI de sexe pratiqué par la technique díhybridation fluorescente in situ (FISH) permettant de visualiser la présence des chromosomes X et Y.
 

Erine et Léna, nées le 30 Juillet 2001.

En pratique

Un double diagnostic de mucoviscidose et de sexe a été réalisé avec succès, permettant la naissance de deux enfants en bonne santé. Pour notre patiente, la pratique díun DPN aurait conduit à líinterruption de grossesse de tous les fútus de sexe masculin et des fútus féminins atteints de mucoviscidose, soit théoriquement 5 fútus sur 8 (62,5%).

Dans des situations comme celle-ci, au vu de la probabilité importante díinterruption thérapeutique de grossesse (ITG), líavantage du DPI est clair, díautant plus que la moitié des fútus masculins interrompus níauraient pas hérité du chromosome X morbide. Même si la situation est similaire lors du DPI, il semble préférable de favoriser le transfert díembryons féminins (même si cela implique que líon écarte des embryons masculins sains) que de devoir pratiquer une ITG sur un fútus sain. Pour ces mêmes raisons, le DPI de sexe apparaît justifié pour la súur de notre patiente.

Les naissances qui firent suite à ces DPI démontrent líutilité de cette nouvelle technique qui permet de contribuer légitimement aux aspirations de certains couples fortement éprouvés.
 
 
 

Bibliographie
Handyside A.H., Delhanty J.D. Preimplantation genetic diagnosis : strategies and surprises. Trends Genet., 1997 ; 13 (7) : 270-275.
Hardy K., Martin K.L., Leese H.J., Winston R.M., Handyside A.H. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage. Hum. Reprod., 1990 ; 5 : 708-714.
Ray P.F., Handyside A.H. Increasing the denaturation temperature during the first cycles of amplification reduces allele dropout from single cells for preimplantation genetic diagnosis. Mol. Hum. Reprod., 1996 ; 2 (3) : 213-218.
Ray P. Le diagnostic génétique pré-implantatoire moléculaire. Réalités en Gynécologie-Obstétrique, 2001 ; 59 : 6-10.